导读
畜牧业的快速发展导致动物饲料的需求不断增加。紫花苜蓿具有较高的蛋白质和矿物质含量及良好的适口性，是优质饲料。然而相较于其他牧草，紫花苜蓿（Medicago sativa）饲料有一个潜在的问题，其高缓冲能力和低含量水溶性碳水化合物（WSC）使pH难以降低，而有利于腐败细菌的生长，进而导致存储问题。此外，南方的高湿度和多雨气候进一步加剧了贮藏问题，缩短了青贮保质期。因此为了克服这个问题，需要制定能够有效抑制发酵过程中腐败和不良微生物生长、改善营养保存、延长青贮饲料货架期的策略。
添加外源微生物以提高青贮饲料的生产，不仅能够最大限度地保存营养物质，而且延长了产品的保质期，通过重建宏基因组组装基因组（MAG）和生长速率InDex（GRiD），在青贮发酵第0、7、14、28天监测紫花苜蓿质量和数量的变化（PS-8接种剂量为1×105 CFU/g鲜重；每袋50 kg；每个时间点10袋）。结果表明，外源发酵菌PS-8（L. plantarum）在接种第7天时成为最具优势的菌株，可能在整个发酵过程中发挥了高度活跃的作用。青贮饲料的pH明显下降，同时产酸微生物PS-8的生长抑制了霉菌（4.18 vs 1.42 CFU/g）和大肠菌群（4.95 vs 0.66 MPN/g）的生长，中性洗涤纤维（NDF）含量显著下降（干物质含量为41.6% vs 37.6%）。此外，在整个发酵过程中，编码微生物碳水化合物活性酶（CAZymes）的基因丰度和多样性显著增加，特别是负责降解淀粉、阿拉伯-木聚糖和纤维素的基因。我们的研究结果显示，PS-8在发酵早期和中期快速持续复制，促进有益乳酸菌的生长，抑制不良微生物，最终提高青贮质量。
论文ID
原名：Changes in chemical composition, structural and functional microbiome during Alfalfa (Medicago sativa) ensilage with Lactobacillus plantarum PS-8
译名：植物乳杆菌PS-8对紫花苜蓿青贮过程中化学成分、结构和功能性微生物群的影响
期刊：Animal Nutrition
IF：6.383
发表时间：2022.1.24
通讯作者：刘文俊
通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室
DOI号：10.1016/j.aninu.2021.12.004
实验设计
将新鲜紫花苜蓿带到青贮地点，在阳光下枯萎至约50%的水分含量，把饲料切碎后喷洒PS-8（1×105CFU/g），随机装入真空密封聚乙烯塑料袋中（每袋约50 kg；共40袋），包装的青贮样品保存在室温（20-25℃），且28天没有任何气体调节措施，在第0、7、14和28天采集新鲜（标记为d0）和封闭的材料进行微生物和化学分析。除第0天外，每个时间点共打开10个包装袋取样，采集浓缩样本进行细菌宏基因组学和化学成分分析。青贮样品（每个25 g）加入225 mL去离子水中涡旋混合30 min，使用pH仪进行pH测定，在55℃的强制空气烘箱中干燥72 h后测定干物质（DM）含量，再研磨进行粗蛋白（CP）、可溶性蛋白（SP）、酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）、WSC和氨氮（NH3-N）分析，乳酸、乙酸、γ-氨基丁酸和苯基乳酸的检测采用超高性能液相色谱-电喷雾电离-四极飞行时间质谱测定。每个样品25 g用无菌PBS溶液稀释10次，4℃下浸泡24 h，然后用无菌纱布过滤，滤液离心，收集细菌泥浆的沉淀物，使用E.Z.N.A.土壤DNA试剂盒进行样品DNA提取，并用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度分析检测提取的DNA的质量，制备片段的DNA文库（约400 bp长），这些样品在Illumina HiSeq Xten仪器上进行鸟枪法宏基因组测序，正向和反向均产生配对端reads（151 bp）。
图1 实验设计图
前言
内生青贮饲料是一种传统的基于微生物厌氧发酵的饲料保存方法，主要采用乳酸菌（LAB）。在此过程中，绿色原料中WSC发酵成如乳酸和醋酸的有机酸，导致pH下降，抑制不良微生物生长。虽然在青贮发酵过程中约有10%的营养损失，但在发酵中产生的有机酸和有机螯合物矿物质更容易被反刍动物吸收。最常见的LAB是同型发酵，如植物乳杆菌和豌豆球菌，纯乳酸发酵是理想的，因为它具有极高的理论DM回收率和乳酸的高效生产，乳酸的释放导致pH比其他类型酸下降地更快。发酵是一个微生物驱动的过程，青贮发酵的质量高度依赖于青贮过程中涉及微生物的活动和类型，加速其他微生物对WSC的利用速度，并产生有机酸的有益微生物对青贮发酵过程贡献很大，相比之下，一些不受欢迎的微生物可能会导致青贮饲料的腐败。本研究选择接种同型发酵实验室菌株PS-8对紫花苜蓿青贮发酵的影响，在之前的研究中，该菌株已被证明有利于提高青贮发酵和牛奶生产的质量和数量，PS-8的贡献可以通过监测复杂附生植物微生物群落的演替与青贮饲料化学成分的变化来评价。
研究假设添加外源LAB可以通过调节青贮微生物群来改善紫花苜蓿的青贮过程，虽然之前的一些工作研究了微生物青贮发酵剂在青贮过程的应用，但很少有通过全基因组宏基因组学方法对微生物动态进行深入研究，有助于揭示青贮微生物群和PS-8在不同发酵阶段的功能潜力和活力。因此本研究利用宏基因组分析，研究了PS-8作为青贮发酵剂菌株在促进青贮发酵中的贡献，采用单样本宏基因组组装方法，对其微生物群落结构和功能进行了动态评估，重点研究了紫花苜蓿青贮发酵不同阶段的GRiD和碳水化合物代谢的变化，同时对青贮发酵过程中的一些化学参数进行了监测。
实验结果
1 紫花苜蓿青贮发酵过程中的化学变化
监测发酵青贮饲料化学方面（如化学成分、微生物群和pH）的变化可以为青贮饲料发酵的进展和质量提供指示。在青贮发酵过程中，DM含量无明显变化，SP含量随发酵时间的增加而增加，虽然含量变化不显著，但有明显的增加趋势。NH3-N含量在前7天显著增加（P<0 .05），在第7~14天之间达到稳定阶段，然后在第14~28天之间显著下降（P<0 .05）。NDF在第7天时显著下降（P<0 .05），此后无显著变化，wsc总体上呈下降趋势（表1）。
乳酸含量随发酵时间的增加而显著增加，并在第28天时达到最大值（P<0 .05），乙酸含量呈上升趋势，在第14天和28天时均有显著增加（P<0 .05），γ-氨基丁酸含量在第14天开始显著增加（P<0 .05），苯基乳酸含量在第14~28天显著增加（P<0 .05）。发酵过程中有机酸含量持续积累，霉菌和大肠菌群的数量被显著抑制，并降低到检测限以下的水平（表1；表s2），紫花苜蓿青贮饲料的ph值从第7天开始显著下降（P<0 .05）。
表1 紫花苜蓿青贮过程中理化参数、霉菌和大肠菌群计数的变化。
（SEM=平均标准误差；MPN=最可能数；a-d不同时间点相同参数的数据采用Kruskal-Wallis检验进行统计学比较；用不同的字母表示有显著性差异（P<0 .05）。
2 发酵过程中青贮微生物群的动态变化
为了解微生物对青贮发酵的贡献，采用鸟枪法宏基因组测序技术分析了PS-8青贮微生物群在发酵前后和发酵第7、14、28天的动态变化，测序数据量见表S1。发酵过程分为2个阶段，即微生物变化剧烈的（L. plantarum和Pediococcus pentosaceus）增殖阶段（第0~7天）和微生物变化不明显的稳定阶段（第7~28天）。
青贮微生物群的alpha多样性在早期显著增加（P<0 .001），随后在稳定期略有波动（图2a）。基于bray-curtis距离进行的pcoa也表明，初始青贮微生物群（d0）在结构上与后来的时间点不同（图2b）。紫花苜蓿青贮微生物群在稳定期（第7~28天）的Bray-Curtis距离明显低于第0天的基线水平（图2C）。
在种水平上，所有样本中均鉴定出7种主要细菌类别（图2D），发酵前后的微生物区系组成存在明显差异，在第0天，青贮微生物群主要为Weissella cibaria （82.4%）和Pantoea agglomerans（3.22%），以紫花苜蓿附生种序列为主，第7天后，青贮微生物群组成保持稳定，主要以L. plantarum（31.4%）、W. cibaria（31.2%）和P. pentosaceus（11.4%）3种序列为主。发酵开始后，W. cibaria的相对丰度显著降低，而L. plantarum和P. pentosaceus的相对丰度显著增加，分别在发酵第28天和第7天达到最高水平。
然后采用LDA、Kruskal-Wallis检验和Wilcoxon秩和检验来确定d0和d7样品之间的微生物组成的差异。LDA结果显示，W. cibaria和Pantoea ananatis在第0天富集（P<0 .05），而L. plantarum、P. pentosaceus、L. sakei、L. pentosus、L. coryniformi、Lactococcus garvieae、Pediococcus lolii、Weissella paramesenteroides、 L. curvatus、L. brevis和L. farciminis 在第7天富集（P<0 .05；图2e），这些差异丰富的类群是导致发酵前后微生物群结构差异的主要原因。
青贮化学参数与物种水平微生物组成之间存在频繁的相关性（图2F）。发酵开始后，一些种（包括L. plantarum、W. paramesenteroides、L. brevis、L. curvatus和L. farciminis）与化学参数（包括4种有机酸，特别是乳酸、SP和NH3-N）呈正相关，这些物种与pH、霉菌和大肠菌群的数量、NDF和WSC呈负相关。
图2 不同时间点紫花苜蓿青贮微生物群落结构与理化指标的关系（A）箱线图显示Shannon多样性指数。（B）主坐标分析（PCoA；Bray-Curtis距离）。（C）Bray-Curtis距离。用不同的字母表示有显著性差异（P<0 .05），利用局部估计的散点图平滑（黄土）对数据进行曲线拟合，粉红色区域对应于曲线的95%置信区间。（d）堆叠柱状图显示了已鉴定物种的相对丰度。（e）线性判别分析（lda）显示在d0和d7之间存在差异丰富的类群。（f）15个优势种和14个生物/化学参数的spearman相关热图。mpn="最有可能的数字。颜色尺度代表了Spearman的rho，显示了相关性的强度。（*" P < 0.05, ** P < 0.01, ***P < 0.001）（原文图1）。
3 青贮微生物群的种类水平及PS-8含量的变化
青贮微生物区系的变化表明，植物乳杆菌的发酵水平显著升高，并在发酵过程中成为优势种。为了明确PS-8作为外源发酵剂在发酵过程中的作用，我们计算了不同时间点PS-8 reads在全基因组中的相对丰度（图3A；表S1），其比例从第0~7天显著增加，从第7~28天保持稳定，范围为0.5%~29%。通过使用MetaBAT2的宏基因组箱从支架中获得1100个原始箱，然后去除高污染的不完整箱，保留162个高质量MAG（>80%完整性，
